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    Implication des réarrangements génomiques du polyomavirus JC dans la leucoencéphalopathie multifocale progressive

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     Anne-Sophie L'Honneur

    Anne-Sophie L’Honneur

     

    Mardi 9 avril 2019 à 15H


    Salle de conférence Rosalind Franklin, 2 e étage
    Institut Cochin, 22 rue Méchain, Paris 75014



    Directeur de thèse :  Flore Rozenberg

    Equipe :   
    Cellules dendritiques, lymphocytes B et cytokines dans leur microenvironnement au cours des infections virales et du cancer

    Département : Infection, Immunité, Inflammation

    Résumé de thèse :

    Le polyomavirus humain JC (JCV) est un virus ubiquitaire qui infecte de façon persistante et asymptomatique la majorité de la population, entrainant occasionnellement une excrétion urinaire. Dans le contexte d’immunodépression, le JCV peut infecter les cellules gliales du système nerveux central (SNC), provoquant une maladie démyélinisante fatale, la Leucoencéphalopathie Multifocale Progressive (LEMP). Le génome du JCV est un ADN double brin circulaire de 5 kb composé de 2 régions codantes opposées -précoce et tardive- séparées par une région non codante de contrôle (NCCR) gouvernant leur expression. Les séquences NCCR obtenues du SNC de patients atteints de LEMP diffèrent des séquences urinaires dites archétypales par divers réarrangements dont le rôle n’est pas entièrement connu. Pour étudier l’effet de ces réarrangements en culture cellulaire, la technologie des minicercles d’ADN a été adaptée pour produire 4 vecteurs bidirectionnels exprimant deux gènes rapporteurs fluorescents sous le contrôle d’une NCCR archétypale (NCCR at) ou réarrangée (NCCR rr) comportant une délétion de 66 pb. Après transfection de cellules humaines gliales U-87MG et rénales HEK293, l’expression des rapporteurs à partir des NCCR at et rr a été mesurée par cytométrie en flux. L’expression des régions codantes précoce et tardive contrôlée par la NCCR at est semblable dans les cellules HEK293 tandis que dans les cellules U-87MG, l’expression précoce est 2.1 fois supérieure à l’expression tardive (p <0.001). Au contraire, l’expression tardive contrôlée par la NCCR rr est similaire à l’expression précoce dans les cellules U-87MG comme dans les cellules HEK293. Ces résultats suggèrent que la délétion de 66 pb restaure l’expression tardive dans la lignée gliale. L’utilisation de ce modèle in vitro a permis de mettre en évidence un lien particulier entre la séquence NCCR et l’expression dépendant du type cellulaire. Pour mieux décrire la variabilité   des réarrangements et du génome viral, une technique de « single molecule real-time (SMRT) sequencing » a été appliquée aux génomes JCV obtenus de 23 liquides céphalorachidiens (LCR), 1 biopsie cérébrale et 19 prélèvements urinaires de patients atteints de LEMP ainsi que de 5 prélèvement urinaires de patients non atteints de LEMP. L’ensemble du génome du JCV a été amplifié en 2 fragments chevauchants aux deux extrémités, chacun constitué de la NCCR et de l’une ou l’autre des régions codantes. Les amplicons ont été séquencés par la technique SMRT PacBio. L’analyse phylogénétique montre une répartition des souches cérébrales parmi 6 génotypes différents, confirmant l’absence de pathogénicité spécifique de type. Les séquences NCCR cérébrales comportent diverses délétions touchant principalement les sections b, d, et f ainsi que des insertions des sections c et e dupliquées. Chez la majorité des patients atteints de LEMP (18/24), la population virale cérébrale est composée d’au moins 2 formes de NCCR distinctes dont la structure suggère un lien d’apparition chronologique entre ces deux variants. Par ailleurs, des substitutions d’acide aminé au niveau de 7 emplacements déjà décrits dans la protéine VP1 ont été identifiées exclusivement dans les souches cérébrales. Hormis plusieurs mutations en rapport avec des polymorphismes de souches, 2 nouvelles substitutions ont été observées à partir du LCR de deux patients différents situées respectivement dans le domaine hélicase de la séquence AgLT (Tyr407Asn) et dans le domaine N-terminal du gène VP2 (Pro65Ala). Ces mutations pourraient jouer un rôle dans la pathogénicité en modifiant les capacités réplicatives virales, en créant un changement de structure de la particule virale ou en favorisant l’échappement à la réponse immune. Ce travail fournit un argument supplémentaire en faveur de l’implication des réarrangements de la NCCR dans la neuropathogénicité du JCV et apporte un éclairage nouveau sur les populations virales associées à la LEMP.

     

    Mots clefs : Polyomavirus JC, Leucoencephalopathie multifocale progressive, physiopathologie