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    l'étude des mécanismes de résistance des inhibiteurs FLT3 dans les leucémies aiguës myéloïdes

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    Fetta MAZED

     

    Vendredi 22 mars 2019 à 14H


    Salle de conférence Rosalind Franklin, 2 e étage
    Institut Cochin, 22 rue Méchain, Paris 75014



    Directeur de thèse : Jérôme Tamburini

    Equipe :   Hématopoièse normale et pathologique  

    Département : Développement, Reproduction et Cancer

     

    Résumé de thèse :

    Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) constituent un groupe hétérogène d’hémopathies malignes résultant de la prolifération clonale d’un progéniteur myéloïde bloqué dans sa différenciation. Leur incidence est de 3000 nouveaux cas par an en France. Le pronostic des LAM, globalement défavorable, dépend de l’âge et de facteurs cytogénétiques et moléculaires. La mutation du gène FLT3 de type duplication en tandem du domaine juxta-membranaire (ITD pour internal tandem duplication) est détectée dans 30% des échantillons de LAM, corrèle à une fréquence accrue de rechutes et ainsi à un pronostic défavorable. La mutation FLT3-ITD conduit à une activation dérégulée et constitutive de récepteur FLT3, induisant une addiction oncogénique des cellules leucémiques aux voies de signalisation en aval, désignant FLT3 comme cible thérapeutique pertinente dans les LAM. Ainsi, de nombreux inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) ciblant FLT3 ont été développés, certains ayant une efficacité significative en monothérapie et améliorant la survie des patients ayant une mutation FLT3-ITD en association aux traitements conventionnels. Néanmoins, la plupart des patients traités en monothérapie, et une proportion importante de ceux traités en association rechutent en raison de mécanismes de résistance développés par la cellule pour échapper à l’action des ITK. L’étude de ces mécanismes représente donc un enjeu essentiel afin d’améliorer l’efficacité des traitements dans les LAM FLT3-ITD. C’est cette thématique que j’ai souhaité aborder au cours de ma thèse. Nous avons tout d’abord, dans la continuité des travaux de mon équipe, mis en évidence par des approches transcriptomiques et protéomiques une nouvelle cible de PIM2, la sérine thréonine kinase RSK2, ayant un rôle dans le contrôle de l’apoptose des cellules de LAM. Au cours de ce travail, mes collègues et moi-même avons montré que RSK2 était fortement diminuée suite à l’invalidation de PIM2 par interférence ARN dans une lignée de LAM FLT3-ITD (la lignée MOLM-14), tant au niveau ARNm que protéique. Par une technique de sensibilisation à l’apoptose à l’aide de peptides BH3 ainsi que par un inhibiteur de Bcl-2, le composé ABT-199, nous avons montré le rôle de RSK2 dans le contrôle de l’apoptose mitochondriale en contexte FLT3-ITD. Nous avons ensuite observé que la surexpression de RSK2 compensait la mort cellulaire induite par l’invalidation de PIM2, renforçant ainsi le rôle de cette nouvelle voie dans le contrôle de la survie cellulaire. Finalement, nous avons suggéré dans des modèles murins de la maladie que RSK2 pourrait participer à la résistance aux ITK ciblant FLT3. Afin de poser la question de ces mécanismes de résistance sans à priori, j’ai adapté à notre modèle de LAM une banque CRISPR pan-génomique dans le but de la cribler avec différents ITK et ainsi mettre à jour de nouveaux mécanismes de résistance aux ITK. J’ai utilisé l’enzyme dCas9 permettant non pas des cassures de l’ADN mais une modulation de la transcription de gènes cibles, soit une répression lors de la fusion au corépresseur KRAB (CRISPRi), soit une activation lors de la fusion à VP64 (CRISPRa). La dCas9 et les banques ont été transduites par des lentivirus dans 2 lignées FLT3-ITD (MOLM-14 et MV4-11). Ces cellules ont été amplifiées en culture liquide ou sur des cellules stromales mésenchymateuses (MSC) et traitées soit par du DMSO (solvant des ITK), soit par l’un des 3 ITK ciblant FLT3 suivants : quizartinib, midostaurine ou ponatinib. L’identification et la quantification des ARN guides par séquençage haut débit et l’analyse bioinformatique à l’aide d’un logiciel dédié nous renseigne enfin sur les gènes dont la répression favorise l’effet des ITK, pouvant ainsi représenter de nouveaux mécanismes de résistance intrinsèques (culture liquide) et/ou extrinsèques (co-culture MSCs) à la cellule. Le troisième axe de mon travail a porté sur la caractérisation des modifications du profil de signalisation global induites par les mutations du domaine tyrosine kinase (TKD) de FLT3-ITD impliquées dans la résistance aux ITK. Nous avons exprimé les mutations composites de FLT3-ITD retrouvées le plus fréquemment chez les patients après échec des ITK : F691L, D835V et D835Y. Ces mutants ont été exprimés dans la lignée hématopoïétique murine Ba/F3 et traités soit par du DMSO, soit par l’un des 3 ITK cités plus haut. Nous avons ensuite réalisé une expérience de phosphoprotéomique sur puce permettant de détecter la phosphorylation de peptides sur tyrosine ou sur sérine/thréonine après contact avec nos extraits protéiques. Ces expériences ont montré un profil de phosphorylation sur tyrosine attendu, tant à l’état basal qu’en réponse aux ITK (par exemple large spectre d’inhibition par le ponatinib). En revanche, le profil sérine/thréonine est inattendu car très différent dans le cas de la mutation F691L, suggérant des cibles potentielles afin de contourner les mécanismes de résistance enclenchés par cette mutation. Au cours de ma thèse, j’ai ainsi contribué à la caractérisation de RSK2 comme nouvelle cible de PIM2 ayant une possible contribution dans la résistance aux ITK ciblant FLT3. J’ai également développé 2 approches globales afin de mettre en évidence de nouveaux mécanismes de résistance, qui ont permis ou qui vont prochainement permettre de générer des hypothèses qui nécessiteront des confirmations individuelles dans le futur.