Analyse expression genes par NGS ou RNA-seq

La plate-forme propose des prestations de séquençage du transcriptome (total, codant, petits ARN) ou RNA-Seq basées sur l’utilisation du NextSeq 500 d’Illumina.

A partir des ARN fournis par le client, la prestation de base englobe le contrôle qualité des échantillons, la production des banques, leur séquençage et le contrôle qualité des données brutes. Les approches de séquençage (lectures simples ou pairées, profondeur des lectures) sont modulables et adaptables en fonction du projet. Chaque projet fera l’objet d’un devis adapté tenant compte de ces différents aspects.

La plate-forme  propose également une prestation d’analyse des lectures produites (alignement et contrôle qualité des alignements) et une analyse statistique de ces données permettant d’obtenir une liste de gènes différentiellement exprimés.

Les différentes prestations de RNA-Seq proposées englobent le contrôle qualité des ARN fournis par le client, la préparation et le séquençage de la banque et le contrôle qualité des données produites.

On distingue :

•  le séquençage du transcriptome codant après sélection polyA

Principe : sélection des ARN messagers avec des billes oligo dT, puis Reverse Transcription en ADNc (conservation du sens des transcrits), ligation d’adaptateurs Illumina et amplification par PCR.
Quantité d’ARN total : 100 ng – 4 µg
Qualité des ARN recommandée : RIN > 8
Kit utilisé : TruSeq mRNA Stranded (Illumina)
Séquenceur : NextSeq 500 (2 x 75 bp et 1 x 75bp)

•  le séquençage du transcriptome total par déplétion ribosomique

Principe : déplétion des ARN ribosomiques (cytoplasme + mitochondries) avec des sondes biotynilées (sur billes), puis Reverse Transcription en ADNc (conservation du sens des transcrits), ligation d’adaptateurs Illumina et amplification par PCR.
Quantité d’ARN total : 500 ng – 4 µg
Qualité des ARN recommandée : RIN > 8
Kit utilisé : TruSeq total RNA Stranded (Illumina)
Séquenceur : NextSeq 500 (2 x 75 bp et 1 x 75 bp)

•  le séquençage des petits ARN

Principe : à partir des petits ARN purifiés ou d’ARN total, ligation orientée d’adaptateurs, RT-PCR et purification sur gel.
Quantité d’ARN total : 1 µg
Quantité de petits ARN purifiés : 10-50 ng
Kit utilisé : TruSeq Small RNA Library Prep Kit (Illumina)
Séquenceur : NextSeq 500 (1 x 75 bp)

•  le séquençage des ARN en petites quantité (low input)

Principe : enrichissement des ARN totaux, déplétion des transcrits abondants avec la technologie AnyDeplete (ribosomes, globines etc.), ligation d’adaptateurs Illumina et amplification par PCR.
Quantité d’ARN total : 10 pg – 10 ng (1 – 500 cellules)
Qualité des ARN recommandée : RIN > 8
Kit utilisé : Ovation SoLo RNA-Seq (NuGEN)
Séquenceur : NextSeq500 (2 x 75 bp)

Pour cette prestation, GenomIC propose également de réaliser l’étape d’extraction d’ARN total à partir d’une suspension de quelques centaines de cellules. Nous contacter.

En pratique :

Pour toute demande, contactez-nous directement à ngs.u1016@inserm.fr ou au 0140516565.