Institut de recherche biomédicale
     

    Equipements

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      La plate-forme HistIM est  répartie sur 3 pièces, distribuées comme suit:

    a . Une pièce d'imprégnation et d'inclusion en paraffine

    Cette pièce est équipée de:

    -    un automate à imprégnation (VIP, Tissue-Tek, Sakura), acquis en 2003, utilisé uniquement par le personnel de la plate-forme. Il permet la déshydratation automatique et l'imprégnation en paraffine de 150 échantillons à la fois, quelque soit le type tissulaire ou l'espèce,

    -    une hotte chimique,

    -    une table d'inclusion des tissus en paraffine.

     

    b. Une pièce principale

    Une pièce est entièrement réservée aux études histologiques (coupes et colorations). À cet effet, elle est équipée de :

     

    - 1 cryostat (CM350 S, Leica) permettant la réalisation de coupes (minimum 7µm d'épaisseur) à partir de tissus congelés,

    - 2 microtomes (RM 2145 et 2155, Leica), permettant la réalisation de coupes (minimum 4µm d'épaisseur) à partir de tissus fixés, inclus en paraffine. Un microtome est exclusivement réservé au personnel de la plate-forme.

    - un automate de coloration histologique standard (Autostainer, Leica), acquis en 2003. Cette automatisation des colorations sur coupes de tissus congelés ou inclus en paraffine offre la possibilité d'intégrer indépendamment 30 lames toutes les 5 minutes.

    - une chambre de démasquage (Abcys) indispensable pour vos immunomarquages en fluorescence ou visible. Elle permet de démasquer les sites antigéniques de vos coupes de tissus afin de les rendre accessibles aux anticorps, aussi bien sur coupes paraffine que sur coupes congelées. 

    - Un automate d'immunomarquage Bond III (Leica) pour la prise en charge de tout type d'immunomarquage avec en plus un gain de temps et un gain de qualité et qui vous permet dégager du temps pour la mise au point de nouveaux marquages ou autres techniques. De plus, vous n'avez plus rien à acheter, à part vos anticorps primaires. Nous prenons en charge tout le reste (tampon de rinçage, tampon de démasquage, solution de déparaffinage, système de révélation en visible, anticorps secondaire fluo...)
    4 types de marquage sont possibles avec des anticorps primaires de souris ou lapin UNIQUEMENT:

            - En simple marquage Visible DAB
            - En double marquage, Visible, DAB + Substrat Rouge
            - En co-marquage parallèle ou marquage simple fluorescence, Dylight488 ET Dylight 550

    Vous nous apportez vos lames et anticorps primaire avec la demande d'immunomarquage associée sous format papier et que vous nous aurez envoyé par mail. Ce formulaire est téléchargeable sur notre page internet (http://cochin.inserm.fr/plates-formes/histim/charte-et-fonctionnement).

     

    - Un scanner de lames, le "Lamina" de chez Perkin Elmer est un automate capable de faire l'acquisition de vos lames entières en quelques minutes, que ce soit en lumière visible (colorations histologiques ou révélation DAB des immunomarquages) ou en fluorescence, et d'en créer des lames virtuelles de haute résolution. Les lames virtuelles sont ensuite très facilement observables avec le logiciel Pannoramic Viewer, téléchargeable gratuitement sur internet. Avec ce logiciel, vous pouvez zoomer sur les régions qui vous intéressent sans perdre en résolution, en faire des captures, des annotations, des mesures, des comptages manuels. Grâce au logiciel INFORM, associé au scanner de lames, vous pourrez automatiser l'analyse de vos lames en terme de comptage d'objets ou d'évaluation de surface marquée, etc...

    Filtres

    Excitation

    Emission

    Canal

    DAPI

    387 ± 18

    440 ± 44

    1

    FITC

    485 ± 26

    521 ± 27

    2

    TRITC/TsRed

    559 ± 32

    607 ± 40

    3

    Cy5

    649 ± 19

    700 ± 57

    4

    TRITC-BZ-HE

    543 ± 20

    593 ± 40

    5

     

    Les cryostat, microtomes et scanner de lames sont mis à la disposition des utilisateurs formés par le personnel de la plate-forme, après réservation sur le site intranet de Cochin.

    La chambre de démasquage est en libre service, sans réservation, ni tarification. Prévenez-nous tout de même à l'avance pour pouvoir assurer son utilisation dans les meilleures conditions.

    Cette pièce contient également une hotte chimique, une loupe binoculaire et un microscope MZ6 (Leica) multi-têtes, outil indispensable à la formation et permettant également un contrôle constant de la qualité des coupes.

     

    c. Une pièce d'imagerie

    Cette pièce noire contient :

     

         - Un microscope modèle DMR (Leica) pour lumière blanche et fluorescence. Il est doté d'une caméra Sony couleur, d'un logiciel d'acquisition d'images (IM 1000), des grossissements x1,6; 2,5; 10; 20; 40; 63 et 100 à immersion et de filtres pour la lecture sélective de différents fluorochromes (Dapi, GFP, Rhodamine, FITC et lecture mixte FITC / Rhd). Il permet la lecture, l’analyse, le traitement et l’acquisition informatisée des images d’histologie et /ou morphologie. La sauvegarde des informations est à la charge de l’utilisateur. Elle se réalise sur clé USB/disque dur.

     

        - Un microdissecteur laser Arcturus XT pour l'étude de l'expression différentielle de gènes, protéines ou ARN. Ce microscope inverse couplé à un laser infrarouge est entièrement motorisé et piloté par le logiciel Arcturus XT. La technique de microdissection laser permet de s'affranchir de l'hétérogénéité d'un tissu en découpant et en isolant différents types cellulaires ou territoires situés à l’intérieur d’un même tissu. Cette technique se réalise principalement sur coupe congelée, préalablement colorée au crésyl violet ou immunomarquée (visible ou fluorescence). Le recueil de la population cellulaire ou de la région d'intérêt s'effectue à l'aide d'une capsule qui va ensuite s'adapter à un tube (type tube de PCR) contenant le tampon de lyse pour l’extraction des protéines, de l'ADN ou des ARN.

    Applications:

    - Les protéines extraites peuvent ensuite être analysées sur mini-gel de Western blot ou sur capillaires grâce à la technique Nanopro mise au point actuellement sur la plate-forme de protéomique 3P5 (Philippe Chafey).

    - Les ADNs peuvent être analysés par PCR + gel.

    - Les ARNs, après extraction et/ou amplification, peuvent être analysés sur puces ou par RT-PCR, RT-qPCR. Ce travail ainsi que le contrôle qualité peuvent être effectués par la plate-forme Génom'IC (Franck Letourneur).

     Filtres fluorescents disponibles sur notre système:

    Filtres

    Excitation

    Emission

    DAPI

    387 ± 18

    440 ± 44

    FITC

    450-490

    520

    TRITC        

    540/25            

    605/55