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    La transparisation (ou clarification) d'échantillons biologiques : enjeux, méthodes et applications

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    L’imagerie 3D d’organes ou de tissus complexes est un enjeu majeur en microscopie photonique appliquée à la biologie.

    Cependant, les phénomènes de diffusion et d’absorption de la lumière au sein de tels milieux sont un frein intrinsèque à l’exploration en profondeur d’échantillons épais, malgré l’avènement de techniques d’imagerie telles que la microscopie multiphotonique ou les feuilles de lumière. Pour répondre aux besoins de l’imagerie 3D d’échantillons biologiques, un grand nombre de techniques de transparisation d’échantillons ont été développées, certaines à base de solvants organiques, d’autres à base de solutions aqueuses, avec des propriétés différentes et des applications diverses. La communauté des biologistes est très intéressée par cette démarche de transparisation mais souvent dépassée par la multitude des techniques décrites dans la littérature depuis plus de 5 ans. Nous vous proposons d’y voir plus clair en retournant aux origines de la méthode puis en vous décrivant son principe et quelques applications directes.

     

    Pourquoi transpariser un échantillon biologique ?

    Au sein des échantillons biologiques, la diffusion et l’absorption de la lumière rendent l’imagerie en profondeur très difficile. En effet, les différentes molécules composant la matière biologique ayant toutes un indice de réfraction différent, la lumière se trouve fortement diffusée et ce, dès les premiers micromètres atteints. Par conséquent, les échantillons biologiques épais et denses optiquement étaient jusqu’à présent coupés en fines tranches pour permettre une imagerie en volume. Ces dix dernières années, des progrès fantastiques ont été réalisés dans le but de rendre les échantillons transparents à la lumière visible, permettant ainsi la visualisation en microscopie d’organes entiers.

     

    Légende : cerveau de souris transparisé par la technique Clarity.
    Image de Kwanghun Chung et Karl Deisseroth, Howard Hughes Medical Institute/Stanford University

     

    Les techniques de transparisation

    Le traitement des échantillons a 3 objectifs :

    • Supprimer (ou réduire) l’opacité des cellules due aux lipides membranaires sans endommager les cellules
    • Décolorer les pigments
    • Homogénéiser les indices de réfraction pour limiter les phénomènes de réfraction et de diffusion

    Chaque méthode employée aura des avantages et des inconvénients quant à la conservation des structures tissulaires, de leur volume, de la fluorescence endogène, etc. Ces méthodes de transparisation peuvent être classées en deux grandes catégories :

    Techniques à base de solvant organiques :
    L’échantillon biologique est tout d’abord déshydraté, délipidé, puis décoloré, un peu comme avec de l’eau de Javel. Puis l’indice de réfraction de l’échantillon est homogénéisé à l’aide de solvants organiques. Les techniques les plus courantes sont le BABB [Spalteholz, 1914], le 3DISCO [Ertürk et al., 2012], le iDISCO+ [Renier et al., 2016] et le uDICO [Ertürk et al., 2016]. Ces techniques sont fiables, reproductibles et parfaitement adaptées à la transparisation de gros volumes. Cependant, elles sont fortement toxiques du fait de l’utilisation de solvants organiques, et peuvent induire des artefacts tels que la réduction de taille des volumes (shrinkage) ou le quenching de la fluorescence de protéines endogènes telles que la GFP par exemple.

    Techniques à base d’agents hydrophiles :
    Cette catégorie peut être divisée en trois sous-groupes :

    1. Immersion simple.
      Ici, l’indice de réfraction est adapté à l’échantillon en l’immergeant simplement dans un milieu adapté (TDE, Fructose – méthode SeeDB [Ke et al., 2013 ; 2016], Glycérol). Cette technique est simple à réaliser, fonctionne parfaitement pour de petits échantillons, n’induit pas de « shrinkage », est compatible avec des marquages immunofluorescents et conserve la fluorescence endogène. En revanche, la transparisation est rarement complète, est très lente, et ne fonctionne pas sur de gros volumes.
    2. Hyper-hydratation.
      Les lipides sont enlevés à l’aide de détergents puis du sucrose ou de l’urée permettent l’hydratation et la transparisation des échantillons. Les techniques usuelles sont : CUBIC [Susaki et al., 2014 ; 2015], Scale [Hama et al., 2011 ; 2015], Fruit [Hou et al., 2015]. Ces méthodes sont efficaces, ne « quenchent » pas la fluorescence endogène mais elles sont lentes et induisent une légère expansion de l’échantillon.
    3. Inclusion hydrogel.
      L’échantillon est inclus dans de l’hydrogel et les lipides sont enlevés avec du détergent ou par électrophorèse. L’homogénéisation de l’indice de réfraction est atteinte en utilisant des milieux tels que le TDE, FocusClear, RIMS, ou Glycerol. Les techniques les plus utilisées sont CLARITY [Chung et al., 2013 ; Tomer et al., 2014], PACT/PARS [Yang et al., 2014 ; Treweek et al., 2015], ou encore SWITCH [Murray et al., 2015]. Ces méthodes sont adaptées à la transparisation de petits animaux entiers, n’induisent pas de quenching de la fluorescence endogène mais sont plutôt lentes et requièrent parfois un équipement particulier.

     

    L’imagerie d’échantillons transparisés

    D’un point de vue pratique, l’imagerie d’échantillons biologiques en volumes requiert des techniques d’imagerie avec les particularités suivantes :

    • Sectionnement optique en z (exit les pleins champs)
    • Grand champ de vue de l’objectif imageur (exit les trop forts grossissements)
    • Une excitation localisée au foyer de l’objectif serait un plus pour ne pas dégrader l’échantillon trop rapidement.

    Ensuite, pour pouvoir imager correctement les tissus transparisés, il est nécessaire de les laisser immergés dans leur milieu permettant l’adaptation de l’indice de réfraction. En effet, sortis de leurs milieux, ces échantillons redeviennent opaques. Prenant en compte cette contrainte, de nombreuses astuces pour permettre la préparation des échantillons en vue de l’imagerie ont été inventées (impression de chambres en 3D par exemple). Deux techniques de microscopie optique sont particulièrement adaptées pour imager des tissus épais in toto : les modalités confocales/multiphotoniques et la microscopie à feuille de lumière.

     

    Légende : Rein de souris entier transparisé par la technique BABB ; rouge : vaisseaux sanguins et podocytes dans les néphrons/griffonia simplicifolia agglitinin ; vert : /cellules tubulaires peanut agglutinin (lectines)
    imagerie mutliphotonique ; collaboration Marco Pontoglio / Thomas Guilbert / IMAG’IC, Institut Cochin

     

    Les microscopes confocaux sont très répandus dans les laboratoires de recherche. De type scanner à point ou spinning-disk, la vitesse d’acquisition d’image est assez rapide, la gamme d’objectifs disponibles est telle qu’il est possible d’allier grand champ de vue et bonne résolution, et le sectionnement optique se fait à la détection. A noter qu’il existe désormais sur le marché des objectifs à immersion permettant d’imager directement dans certain milieu de transparisation.  Cependant, si la transparisation de l’échantillon n’est pas parfaite, le phénomène de diffusion des photons dans la matière biologique entraînera une dégradation de la qualité des images au fur et à mesure de la progression en z. L’imagerie d’échantillons volumineux posera également problème puisque l’excitation de la fluorescence a lieu en volume, augmentant le risque de photo-blanchiment. Enfin, toujours pour un échantillon de grande taille, le nombre d’images nécessaires pour couvrir tout l’échantillon peut devenir considérable, tout comme le poids de celles-ci (plusieurs centaines de Go) ne facilitant ainsi ni la reconstruction du volume en 3D, ni le traitement d’images qui en découle.

    La microscopie multiphotonique a connu un essor considérable depuis le début des années 2000. S’ajoute aux avantages de la microscopie confocale, le sectionnement optique intrinsèque lié à la technique même, ainsi que l’excitation dans l’infra-rouge, qui lui confère une place de choix dans l’imagerie d’échantillons épais. Cependant, les problèmes liés au nombre et au volume d’images restent les mêmes qu’avec la microscopie confocale.

    La microscopie à feuille de lumière (Selective Plane Illumination Microscopy) est une technique qui a connu de nombreuses améliorations ces dernières années, bien qu’elle date des années 1900 (développée par Siedentopf et Zsigmondy). Par cette technique, on obtient un sectionnement optique non plus en un point, mais sur toute une surface en faisant passer le faisceau de lumière excitateur par une lentille cylindrique. Un second objectif, imageur, permet alors d’acquérir la fluorescence émise par l’échantillon sur une surface correspondant à son champ de vue, avec une résolution en z – soit l’épaisseur de la feuille de lumière – de quelques µm. En dehors des systèmes développés en laboratoire, le système le plus répandu est un macro-SPIM (grossissement max 12x), et si on perd en résolution par rapport aux techniques décrites précédemment, on gagne considérablement en temps d’acquisition.

     

    Nous l’avons vu, la transparisation (ou clarification) d’échantillons est en plein essor, de nouveaux milieux voyant le jour tous les ans. Il faut bien garder à l’esprit que la question biologique reste fondamentale quand on cherche à utiliser ce type d’approches, car en fonction de l’échantillon à observer et du système imageur à disposition, il y aura forcément une technique plus adaptée que les autres, mais qui ne sera en aucun cas « magique ».

     

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