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    SILAC (Stable Isotope Labelling by Amino acids in Cell culture) :

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    Une méthode globale de protéomique quantitative

    Principe général

    La méthodologie SILAC permet de détecter des changements quantitatifs au niveau protéique entre échantillons biologiques. Les cellules d’intérêt sont cultivées dans un milieu contenant des acides aminés naturels (Lysine et Arginine) dits « légers » (condition standard) ou bien leurs équivalents « lourds ». Les acides aminés lourds contiennent des isotopes non radioactifs tels que C13 et N15.

    Ces acides aminés s’incorporent aux protéines au fur et à mesure des divisions cellulaires successives lors des passages des cellules en culture. Une fois l’incorporation complète (quelques passages), les cellules cultivées en milieu standard ou lourd sont traitées selon les conditions d’intérêt (par exemple : infectées ou non, inhibées ou non) puis mélangées afin de générer un seul échantillon et lysées ; enfin l’extrait protéique est soumis à une digestion par la trypsine

    L’analyse par spectrométrie de masse permet de mettre en valeur une différence de masse peptidique entre les peptides légers et les peptides lourds, ce qui constitue un marqueur de l’échantillon d’origine.

    Le ratio des intensités peptidiques lourd/léger est utilisé pour obtenir la quantification relative des protéines entre les conditions testées.

     

    Exemple d’application :

    L’équipe de Florence Margottin-Goguet a utilisé la méthode SILAC afin d’étudier les protéines dont l’expression est modulée par des particules contenant la protéine virale auxiliaire du HIV-1 : Vpr.

    Vpr est une protéine du virus HIV-1, qui induit un arrêt du cycle cellulaire en phase G2 via le recrutement d’une ubiquitine ligase (Le Rouzic et al, Cell Cycle 2007). L’équipe a fait l’hypothèse que ce mécanisme permettait à Vpr d’induire la dégradation d’un ou de plusieurs facteurs cellulaires inhibiteurs de la réplication virale. C’est ainsi que d’autres protéines virales des virus HIV, via le détournement d’ubiquitine ligases, inactivent des facteurs de restriction (Vif induit la dégradation d’APOBEC3G, Vpu de tetherin/BST-2, Vpx de SAMHD1 par exemple). Afin de tester son hypothèse, l’équipe, en collaboration avec la plateforme de protéomique, a choisi la méthodologie SILAC, particulièrement puissante et efficace pour identifier des variations protéiques entre échantillons. Dans le cas précis, les cellules ont été mises en présence de la protéine virale Vpr sauvage, d’une version mutée défective pour l’arrêt du cycle cellulaire, ou dans une 3ème condition de la protéine virale Vpx du virus HIV-2 (avec incorporation d’un 3ème type d’isotopes).

    L’analyse protéomique du contenu nucléaire des cellules infectées a permis d’identifier et de quantifier plus de 3000 protéines. Certaines de ces protéines, stabilisées avec Vpr wt (mais pas avec Vpr mutée) sont connues pour s’accumuler en phase G2, ce qui valide la stratégie. Par ailleurs l’analyse SILAC a permis d’identifier une nouvelle cible cellulaire dont Vpr induit la dégradation : l’ADN translocase HLTF (Helicase-like transcription factor), une protéine impliquée dans la réparation de fourches de réplication défectueuses. Ce travail pourrait conduire à l’identification de nouveaux mécanismes de défense cellulaire. Il a donné lieu à une publication : Lahouassa H.,  Blondot ML et al. HIV-1 Vpr degrades the HLTF DNA translocase in T cells and macrophages. PNAS-2016.

     

    Comment savoir si cette technique est adaptée à votre projet ?

    A l’heure actuelle, la méthode protéomique la plus sensible proposée par la plateforme est la méthode label free décrite dans un précédent focus. Cependant, le marquage SILAC offre des avantages spécifiques :

    • Le SILAC pulsé permet d’identifier les protéines néo-synthétisées et de mesurer leur taux de renouvellement. Le principe est de mettre les cellules en culture dans un milieu alourdi à un instant t0 et de faire des prélèvements à intervalles de temps réguliers.
    • La possibilité de mélanger les échantillons juste avant la lyse cellulaire permet de diminuer le biais technique et c’est un avantage si l’on souhaite étudier des fractionnements subcellulaires (noyaux, ribosomes…).
    • En protéomique, les kératines provenant des cellules épithéliales sont des contaminants fréquents. Ainsi, lorsque l’étude concerne ce type cellulaire, il est préférable d’effectuer un marquage afin de distinguer les protéines contaminantes des protéines issues des cellules étudiées.

     

    Dans tous les cas, une réunion en amont de votre projet avec les membres de la plateforme permettra de choisir la méthode la mieux adaptée à la question posée.

     

    Plateforme Protéomique 3P5 Contact :

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